SmartSeq2(Smart Sequencing Technology 2)

SmartSeq2(Smart Sequencing Technology 2)는 RNA 시퀀싱 기술 중 하나로, 단일 세포 RNA 시퀀싱(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)에서 주로 사용됩니다. 이 기술은 세포 내에서 발현되는 전체 전사체(transcriptome)를 높은 민감도로 분석할 수 있도록 개발되었습니다.

 

출처 https://www.illumina.com/science/sequencing-method-explorer/kits-and-arrays/smart-seq2.html

1. mRNA 추출 및 역전사 준비:
   • 우선, 단일 세포에서 추출된 mRNA가 분석의 시작점입니다. mRNA에는 폴리(A) 꼬리가 존재하며, 이는 SmartSeq2에서 중요하게 사용됩니다.
   • SmartSeq2는 RNA의 5' 말단에서 특수한 스위칭 메커니즘을 사용하여 전사체의 첫 번째 가닥 합성에 중요한 역할을 합니다.
2. mRNA 조각화 (Fragmentation):
   • mRNA는 짧은 조각으로 절단되어 역전사(reverse transcription)를 위해 준비됩니다.
3. 첫 번째 가닥 합성:
   • Moloney murine leukemia virus (MMLV) 역전사 효소가 사용되어 mRNA로부터 첫 번째 cDNA 가닥이 합성됩니다. 이 과정에서 어댑터(Adaptor)가 붙게 됩니다.
4. 템플릿 스위칭 (Template Switching):
   • SmartSeq2의 중요한 특징 중 하나인 템플릿 스위칭이 일어납니다. 이는 효소가 cDNA 합성 중에 특수한 템플릿으로 전환하도록 유도하여 전체 전사체의 끝까지 읽어낼 수 있게 합니다.
5. cDNA 합성:
   • 템플릿 스위칭이 완료되면, 결과적으로 전체 mRNA 전사체를 나타내는 cDNA가 만들어집니다.
6. PCR 증폭:
   • 합성된 cDNA는 PCR을 통해 증폭됩니다. 이를 통해 충분한 양의 cDNA를 확보하게 됩니다.
7. Tagmentation:
   • Tagmentation이라는 과정에서는 TN5 트랜스포스라는 효소를 사용하여 DNA에 작은 태그(tag)를 부착합니다. 이 태그는 이후 시퀀싱 과정에서 각 조각을 구분할 수 있도록 도와줍니다.
8. 갭 수리, 증폭 및 정제 (Gap Repair, Enrichment PCR, and Purification):
   • 이 단계에서는 PCR을 통해 갭이 수리되고, 시퀀싱을 위한 준비가 완료됩니다. 또한, PCR 정제를 통해 필요 없는 산물들을 제거하여 분석에 적합한 cDNA가 확보됩니다.
9. 최종 준비 (Enrichment-ready Fragment):
   • 마지막으로, 시퀀싱 준비가 완료된 cDNA 조각들이 생성됩니다. 이들은 P5와 P7 인덱스를 포함하고 있어 이후 시퀀싱 라이브러리에 사용됩니다.

 

SmartSeq2의 절차 요약

1. 단일 세포 분리: SmartSeq2는 일반적으로 마이크로피펫팅이나 유세포 분석기(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 등을 사용하여 개별 세포를 분리하는 것으로 시작합니다.
2. 역전사: 분리된 세포의 RNA는 먼저 역전사(reverse transcription)를 통해 cDNA로 변환됩니다. SmartSeq2는 이 과정에서 유전자 전체의 cDNA를 합성하는 것이 특징입니다.
3. cDNA 증폭: 생성된 cDNA는 다음 단계에서 증폭되어 다량의 cDNA가 확보됩니다. SmartSeq2는 매우 효율적인 증폭 메커니즘을 사용해 전체 전사체를 증폭할 수 있도록 최적화되어 있습니다.
4. 라이브러리 준비 및 시퀀싱: 증폭된 cDNA는 시퀀싱 라이브러리로 변환되어 차세대 시퀀싱(NGS) 플랫폼을 사용해 시퀀싱됩니다. 이 과정에서 많은 양의 데이터가 생성되어 개별 세포의 유전자 발현 상태를 분석할 수 있게 됩니다.

< 요약 >
SmartSeq2는 full-length cDNA(즉, RNA의 전체 길이)를 합성하고 증폭하는 기술이 사용하여, 개별 세포의 유전자 발현 패턴과 유전자 변이 및 대립유전자 발현 양상 등을 분석한다.